naujienos

Per pastarąjį dešimtmetį genų sekoskaitos technologija buvo plačiai naudojama vėžio tyrimuose ir klinikinėje praktikoje, tapdama svarbia priemone, padedančia atskleisti vėžio molekulines charakteristikas. Molekulinės diagnostikos ir tikslinės terapijos pažanga paskatino tiksliosios navikų terapijos koncepcijų plėtrą ir atnešė didelių pokyčių visoje navikų diagnostikos ir gydymo srityje. Genetiniai tyrimai gali būti naudojami įspėti apie vėžio riziką, nukreipti gydymo sprendimus ir įvertinti prognozę, be to, tai yra svarbi priemonė pacientų klinikiniams rezultatams gerinti. Čia apibendriname naujausius straipsnius, paskelbtus CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol ir kituose žurnaluose, kuriuose apžvelgiamas genetinių tyrimų taikymas vėžio diagnostikoje ir gydyme.

Somatinės mutacijos ir gemalo linijų mutacijos. Paprastai vėžį sukelia DNR mutacijos, kurios gali būti paveldimos iš tėvų (gemalo linijų mutacijos) arba įgytos su amžiumi (somatinės mutacijos). Gemalo linijų mutacijos atsiranda nuo gimimo, o mutatorius paprastai turi mutaciją kiekvienos kūno ląstelės DNR ir gali būti perduodamas palikuonims. Somatines mutacijas įgyja individai ne gametinėse ląstelėse ir paprastai neperduodamos palikuonims. Tiek gemalo linijų, tiek somatinės mutacijos gali sunaikinti normalų ląstelių funkcinį aktyvumą ir sukelti piktybinę ląstelių transformaciją. Somatinės mutacijos yra pagrindinis piktybinių navikų variklis ir labiausiai nuspėjamas biožymuo onkologijoje; tačiau maždaug 10–20 procentų navikais sergančių pacientų turi gemalo linijų mutacijas, kurios žymiai padidina jų vėžio riziką, o kai kurios iš šių mutacijų taip pat yra terapinės.
Vairuotojo mutacija ir keleivio mutacija. Ne visi DNR variantai veikia ląstelės funkciją; vidutiniškai reikia nuo penkių iki dešimties genominių įvykių, vadinamų „vairuotojo mutacijomis“, kad sukeltų normalią ląstelių degeneraciją. Vairuotojo mutacijos dažnai atsiranda genuose, glaudžiai susijusiuose su ląstelės gyvybine veikla, tokiuose kaip genai, dalyvaujantys ląstelių augimo reguliavime, DNR atkūrime, ląstelių ciklo kontrolėje ir kituose gyvybiniuose procesuose, ir turi potencialą būti naudojamos kaip terapiniai taikiniai. Tačiau bendras mutacijų skaičius bet kuriame vėžio tipe yra gana didelis – nuo ​​kelių tūkstančių kai kuriuose krūties vėžiuose iki daugiau nei 100 000 kai kuriuose labai kintančiuose kolorektaliniuose ir endometriumo vėžiuose. Dauguma mutacijų neturi jokios biologinės reikšmės arba yra ribotos, net jei mutacija įvyksta koduojančiame regione, tokie nereikšmingi mutacijos įvykiai vadinami „keleivio mutacijomis“. Jei geno variantas tam tikro tipo navike numato jo atsaką į gydymą arba atsparumą jam, variantas laikomas kliniškai operuojamu.
Onkogenai ir naviką slopinantys genai. Genus, kurie dažnai mutuoja sergant vėžiu, galima grubiai suskirstyti į dvi kategorijas: onkogenus ir naviką slopinančius genus. Normaliose ląstelėse onkogenų koduojamas baltymas daugiausia atlieka ląstelių proliferacijos skatinimo ir ląstelių apoptozės slopinimo vaidmenį, o onkosupresorių genų koduojamas baltymas daugiausia yra atsakingas už neigiamą ląstelių dalijimosi reguliavimą, siekiant palaikyti normalią ląstelių funkciją. Piktybinės transformacijos procese genomo mutacija padidina onkogenų aktyvumą ir sumažina arba visiškai praranda onkosupresorių genų aktyvumą.
Maža variacija ir struktūrinė variacija. Tai du pagrindiniai genomo mutacijų tipai. Maži variantai keičia DNR pakeisdami, ištrindami arba pridėdami nedidelį skaičių bazių, įskaitant bazės įterpimą, ištrynimą, rėmelio poslinkį, pradinio kodono praradimą, stabdymo kodono praradimo mutacijas ir kt. Struktūrinė variacija yra didelis genomo pertvarkymas, apimantis genų segmentus, kurių dydis svyruoja nuo kelių tūkstančių bazių iki didžiosios chromosomos dalies, įskaitant genų kopijų skaičiaus pokyčius, chromosomų ištrynimą, dubliavimąsi, inversiją arba translokaciją. Šios mutacijos gali sukelti baltymų funkcijos sumažėjimą arba sustiprėjimą. Be pokyčių atskirų genų lygmenyje, genominiai parašai taip pat yra klinikinių sekoskaitos ataskaitų dalis. Genominiai parašai gali būti vertinami kaip sudėtingi mažų ir (arba) struktūrinių variacijų modeliai, įskaitant naviko mutacijų kiekį (TMB), mikrosatelitų nestabilumą (MSI) ir homologiškus rekombinacijos defektus.

Kloninės mutacijos ir subkloninės mutacijos. Kloninės mutacijos yra visose naviko ląstelėse, yra diagnozės metu ir išlieka tęsiantis gydymui. Todėl kloninės mutacijos gali būti naudojamos kaip naviko gydymo taikiniai. Subkloninės mutacijos yra tik dalyje vėžio ląstelių ir gali būti aptiktos diagnozės pradžioje, tačiau išnyksta vėliau pasikartojant arba atsiranda tik po gydymo. Vėžio heterogeniškumas reiškia kelių subkloninių mutacijų buvimą viename vėžyje. Pažymėtina, kad didžioji dauguma kliniškai reikšmingų visų įprastų vėžio rūšių mutacijų yra kloninės mutacijos ir išlieka stabilios viso vėžio progresavimo metu. Atsparumas, kurį dažnai sukelia subklonai, gali būti neaptiktas diagnozės metu, bet atsiranda, kai po gydymo liga atsinaujina.

Tradicinė FISH arba ląstelių kariotipo technika naudojama chromosomų lygmens pokyčiams aptikti. FISH gali būti naudojamas genų susiliejimams, delecijoms ir amplifikacijoms aptikti ir yra laikomas „auksiniu standartu“ tokiems variantams aptikti, pasižyminčiu dideliu tikslumu ir jautrumu, tačiau ribotu našumu. Kai kurių hematologinių piktybinių navikų, ypač ūminės leukemijos, atveju kariotipizavimas vis dar naudojamas diagnozei ir prognozei nustatyti, tačiau šią techniką pamažu keičia tiksliniai molekuliniai tyrimai, tokie kaip FISH, WGS ir NGS.
Atskirų genų pokyčius galima nustatyti PGR metodu, tiek realaus laiko PGR, tiek skaitmeniniu lašeliniu PGR metodu. Šie metodai pasižymi dideliu jautrumu, ypač tinka mažų likusių pažeidimų aptikimui ir stebėjimui, ir gali gauti rezultatus per gana trumpą laiką, trūkumas yra tas, kad aptikimo diapazonas yra ribotas (paprastai aptinkamos tik vieno ar kelių genų mutacijos), ir ribota galimybė atlikti kelis tyrimus.
Imunohistochemija (IHC) yra baltymų pagrindu veikianti stebėjimo priemonė, dažniausiai naudojama biožymenų, tokių kaip ERBB2 (HER2) ir estrogenų receptoriai, raiškai aptikti. IHC taip pat gali būti naudojama specifiniams mutavusiems baltymams (pvz., BRAF V600E) ir specifiniams genų susiliejimams (pvz., ALK susiliejimams) aptikti. IHC privalumas yra tas, kad jį galima lengvai integruoti į įprastinį audinių analizės procesą, todėl jį galima derinti su kitais tyrimais. Be to, IHC gali suteikti informacijos apie subląstelinę baltymų lokalizaciją. Trūkumai yra ribotas mastelio keitimas ir dideli organizaciniai reikalavimai.
Antros kartos sekvenavimas (NGS) NGS naudoja didelio našumo lygiagretaus sekvenavimo metodus, skirtus DNR ir (arba) RNR lygmens variacijoms aptikti. Šis metodas gali būti naudojamas tiek viso genomo (WGS), tiek dominančių genų regionų sekvenavimui. WGS suteikia išsamiausią informaciją apie genomo mutacijas, tačiau yra daug kliūčių, trukdančių jį taikyti klinikinėje praktikoje, įskaitant šviežių naviko audinių mėginių poreikį (WGS kol kas netinka formalinu imobilizuotų mėginių analizei) ir didelę kainą.
Tikslinė NGS sekvencija apima viso egzono sekvenavimą ir tikslinių genų grupę. Šie testai praturtina dominančius regionus DNR zondais arba PGR amplifikacija, taip apribodami reikalingos sekvenavimo apimtį (visas egzomas sudaro 1–2 procentus genomo, o net didelės grupės, turinčios 500 genų, sudaro tik 0,1 procento genomo). Nors viso egzono sekvenavimas gerai veikia formalinu fiksuotuose audiniuose, jo kaina išlieka didelė. Tikslinių genų deriniai yra gana ekonomiški ir leidžia lanksčiai pasirinkti tiriamuosius genus. Be to, cirkuliuojanti laisva DNR (cfDNR) tampa nauja vėžiu sergančių pacientų genominės analizės galimybe, vadinama skystąja biopsija. Tiek vėžio ląstelės, tiek normalios ląstelės gali išskirti DNR į kraują, o iš vėžio ląstelių išskirta DNR vadinama cirkuliuojančia naviko DNR (ctDNR), kurią galima analizuoti siekiant aptikti galimas mutacijas naviko ląstelėse.
Tyrimo pasirinkimas priklauso nuo konkrečios klinikinės problemos, kurią reikia spręsti. Dauguma su patvirtintais gydymo būdais susijusių biožymenų gali būti aptikti FISH, IHC ir PGR metodais. Šie metodai yra tinkami nedideliam biožymenų kiekiui aptikti, tačiau jie nepagerina aptikimo efektyvumo didėjant našumui, o jei aptinkama per daug biožymenų, gali nepakakti audinių aptikimui. Kai kurių specifinių vėžio formų, pavyzdžiui, plaučių vėžio, atveju, kai sunku gauti audinių mėginius ir reikia ištirti daug biožymenų, geresnis pasirinkimas yra NGS. Apibendrinant galima teigti, kad tyrimo pasirinkimas priklauso nuo kiekvienam pacientui tiriamų biožymenų skaičiaus ir pacientų, kuriems reikia ištirti biožymenį, skaičiaus. Kai kuriais atvejais pakanka IHC/FISH, ypač kai taikinys jau nustatytas, pavyzdžiui, estrogenų receptorių, progesterono receptorių ir ERBB2 nustatymas krūties vėžiu sergančioms pacientėms. Jei reikia išsamesnio genominių mutacijų tyrimo ir galimų terapinių taikinių paieškos, NGS yra labiau organizuotas ir ekonomiškai efektyvus. Be to, NGS gali būti svarstomas tais atvejais, kai IHC/FISH rezultatai yra dviprasmiški arba neįtikinami.

Įvairiose gairėse pateikiamos rekomendacijos, kurie pacientai turėtų atitikti genetinių tyrimų reikalavimus. 2020 m. ESMO Tiksliosios medicinos darbo grupė paskelbė pirmąsias NGS tyrimų rekomendacijas pacientams, sergantiems išplitusiu vėžiu, rekomenduodama atlikti įprastinius NGS tyrimus išplitusio neplokščialąstelinio nesmulkialąstelinio plaučių vėžio, prostatos vėžio, kolorektalinio vėžio, tulžies latakų vėžio ir kiaušidžių vėžio navikų mėginiams, o 2024 m. ESMO atnaujino rekomendacijas, remdamasi šiuo reiškiniu, rekomenduodama įtraukti krūties vėžį ir retus navikus, tokius kaip virškinimo trakto stromos navikai, sarkomos, skydliaukės vėžys ir nežinomos kilmės vėžys.
2022 m. ASCO klinikinėje nuomonėje dėl somatinio genomo tyrimų pacientams, sergantiems metastazavusiu ar išplitusiu vėžiu, teigiama, kad jei pacientams, sergantiems metastazavusiais ar išplitusiais solidiniais navikais, patvirtinamas su biomarkeriais susijęs gydymas, šiems pacientams rekomenduojama atlikti genetinius tyrimus. Pavyzdžiui, genominiai tyrimai turėtų būti atliekami pacientams, sergantiems metastazine melanoma, siekiant nustatyti BRAF V600E mutacijas, nes šiai indikacijai patvirtinti RAF ir MEK inhibitoriai. Be to, genetiniai tyrimai taip pat turėtų būti atliekami, jei yra aiškus atsparumo pacientui skiriamam vaistui žymuo. Pavyzdžiui, egfrmabas yra neveiksmingas gydant KRAS mutantinį kolorektalinį vėžį. Svarstant paciento tinkamumą genų sekvenavimui, reikėtų integruoti paciento fizinę būklę, gretutines ligas ir naviko stadiją, nes genomo sekvenavimui reikalingi veiksmai, įskaitant paciento sutikimą, laboratorinį apdorojimą ir sekvenavimo rezultatų analizę, reikalauja, kad pacientas turėtų tinkamą fizinį pajėgumą ir gyvenimo trukmę.
Be somatinių mutacijų, kai kuriuos vėžio tipus taip pat reikėtų tirti dėl gemalo linijų genų. Gemalo linijų mutacijų tyrimas gali turėti įtakos gydymo sprendimams dėl tokių vėžio rūšių kaip BRCA1 ir BRCA2 mutacijos krūties, kiaušidžių, prostatos ir kasos vėžiuose. Gemalo linijų mutacijos taip pat gali turėti įtakos būsimai vėžio patikrai ir prevencijai pacientams. Pacientai, kurie gali būti tinkami gemalo linijų mutacijų tyrimui, turi atitikti tam tikras sąlygas, įskaitant tokius veiksnius kaip vėžio šeimos anamnezė, amžius diagnozės metu ir vėžio tipas. Tačiau daugelis pacientų (iki 50 %), turinčių patogenines gemalo linijų mutacijas, neatitinka tradicinių gemalo linijų mutacijų tyrimo kriterijų, pagrįstų šeimos anamneze. Todėl, siekiant kuo labiau padidinti mutacijų nešiotojų identifikavimą, Nacionalinis išsamus vėžio tinklas (NCCN) rekomenduoja, kad visos arba dauguma pacientų, sergančių krūties, kiaušidžių, endometriumo, kasos, kolorektaliniu ar prostatos vėžiu, būtų ištirti dėl gemalo linijų mutacijų.
Kalbant apie genetinių tyrimų laiką, kadangi didžioji dauguma kliniškai reikšmingų vairuotojo mutacijų yra kloninės ir santykinai stabilios vėžio progresavimo metu, genetinius tyrimus pacientams tikslinga atlikti diagnozuojant išplitusį vėžį. Vėlesniems genetiniams tyrimams, ypač po molekulinės tikslinės terapijos, ctDNR tyrimas yra pranašesnis nei naviko audinio DNR tyrimas, nes kraujo DNR gali turėti DNR iš visų naviko pažeidimų, o tai yra palankesnė informacijai apie naviko heterogeniškumą gauti.
ctDNR analizė po gydymo gali padėti numatyti naviko atsaką į gydymą ir nustatyti ligos progresavimą anksčiau nei naudojant standartinius vaizdavimo metodus. Tačiau protokolai, kaip naudoti šiuos duomenis gydymo sprendimams pagrįsti, dar nėra nustatyti, o ctDNR analizė nerekomenduojama, nebent tai būtų atliekama klinikinių tyrimų metu. ctDNR taip pat gali būti naudojama mažiems likusiems pažeidimams po radikalios naviko operacijos įvertinti. ctDNR tyrimas po operacijos yra patikimas vėlesnės ligos progresavimo prognozavimo veiksnys ir gali padėti nustatyti, ar pacientui bus naudinga adjuvantinė chemoterapija, tačiau vis tiek nerekomenduojama naudoti ctDNR už klinikinių tyrimų ribų, siekiant pagrįsti adjuvantinės chemoterapijos sprendimus.

Duomenų apdorojimas Pirmasis genomo sekoskaitos žingsnis yra DNR išskyrimas iš pacientų mėginių, bibliotekų paruošimas ir neapdorotų sekoskaitos duomenų generavimas. Neapdoroti duomenys reikalauja tolesnio apdorojimo, įskaitant žemos kokybės duomenų filtravimą, jų palyginimą su etaloniniu genomu, skirtingų tipų mutacijų identifikavimą taikant skirtingus analitinius algoritmus, šių mutacijų poveikio baltymų transliacijai nustatymą ir gemalo linijos mutacijų filtravimą.
Vairuotojo genų anotacija skirta atskirti vairuotojo ir keleivio mutacijas. Vairuotojo mutacijos lemia naviką slopinančio geno aktyvumo praradimą arba padidėjimą. Maži variantai, dėl kurių inaktyvuojami naviką slopinantys genai, apima nonsensines mutacijas, rėmelio poslinkio mutacijas ir pagrindinių splaisingo vietų mutacijas, taip pat retesnę pradinio kodono deleciją, stop kodono deleciją ir platų introno įterpimo/delecijos mutacijų spektrą. Be to, prasmės mutacijos ir mažos introno įterpimo/delecijos mutacijos taip pat gali sukelti naviką slopinančio geno aktyvumo praradimą, kai paveikia svarbius funkcinius domenus. Struktūriniai variantai, dėl kurių prarandamas naviką slopinančio geno aktyvumas, apima dalinę arba visišką genų deleciją ir kitus genominius variantus, dėl kurių sunaikinamas genų skaitymo rėmelis. Maži variantai, dėl kurių sustiprėja onkogenų funkcija, apima prasmės mutacijas ir retkarčiais pasitaikančius intronų įterpimus/delecijas, kurie nukreipti į svarbius baltymų funkcinius domenus. Retais atvejais baltymų sutrumpinimo arba splaisingo vietos mutacijos gali sukelti onkogenų aktyvaciją. Struktūriniai variantai, dėl kurių aktyvuojami onkogenai, apima genų susiliejimą, genų deleciją ir genų dubliavimąsi.
Klinikinė genomo variacijos interpretacija įvertina nustatytų mutacijų klinikinę reikšmę, t. y. jų galimą diagnostinę, prognostinę ar terapinę vertę. Yra keletas įrodymais pagrįstų vertinimo sistemų, kurios gali būti naudojamos genomo variacijos klinikinei interpretacijai.
Memorialinio Sloan-Kettering vėžio centro tiksliosios medicinos onkologijos duomenų bazėje (OncoKB) genų variantai klasifikuojami į keturis lygius pagal jų prognozinę vertę vaistų vartojimui: 1/2 lygis – FDA patvirtinti arba kliniškai standartiniai biožymenys, kurie prognozuoja konkrečios indikacijos atsaką į patvirtintą vaistą; 3 lygis – FDA patvirtinti arba nepatvirtinti biožymenys, kurie prognozuoja atsaką į naujus tikslinius vaistus, kurie klinikinių tyrimų metu parodė perspektyvius rezultatus, ir 4 lygis – FDA nepatvirtinti biožymenys, kurie prognozuoja atsaką į naujus tikslinius vaistus, kurie klinikinių tyrimų metu parodė įtikinamus biologinius įrodymus. Buvo pridėtas penktas pogrupis, susijęs su atsparumu gydymui.
Amerikos molekulinės patologijos draugijos (AMP) / Amerikos klinikinės onkologijos draugijos (ASCO) / Amerikos patologų kolegijos (CAP) somatinių variacijų interpretavimo gairėse somatinės variacijos skirstomos į keturias kategorijas: I laipsnis – turintis didelę klinikinę reikšmę; II laipsnis – turintis potencialią klinikinę reikšmę; III laipsnis – klinikinė reikšmė nežinoma; IV laipsnis – nežinoma, kad ji kliniškai reikšminga. Tik I ir II laipsnio variantai yra vertingi priimant sprendimus dėl gydymo.
ESMO molekulinio taikinio klinikinio pritaikomumo skalė (ESCAT) klasifikuoja genų variantus į šešis lygius: I lygis – taikiniai, tinkami įprastam naudojimui; II fazės taikinys, kuris vis dar tiriamas, greičiausiai bus naudojamas pacientų populiacijai, kuriai galėtų būti naudingas tikslinis vaistas, atrinkti, tačiau tam pagrįsti reikia daugiau duomenų; III laipsnis – tiksliniai genų variantai, kurie parodė klinikinę naudą kitoms vėžio rūšims; IV laipsnis – tik tiksliniai genų variantai, pagrįsti ikiklinikiniais įrodymais; V laipsnis – yra įrodymų, patvirtinančių klinikinę mutacijos taikymo reikšmę, tačiau vieno vaisto terapija prieš taikinį nepailgina išgyvenamumo arba galima taikyti kombinuoto gydymo strategiją; X laipsnis – klinikinės vertės trūkumas.